Uusi PCR-menetelmä naudanlihan suolistobakteerien havaitsemiseen

Teurastuksen ja myöhemmän käsittelyn aikana patogeeniset suolistobakteerikannat, kuten Escherichia (E.) coli, Salmonella, Shigella ja Citrobacter, voivat päästä tuotteisiin, kuten naudanlihaan. Nopeita ja käytännöllisiä havaitsemismenetelmiä sekä patogeenisille että pilaantumista aiheuttaville bakteereille tarvitaan siksi elintarviketurvallisuuden varmistamiseksi.

Tätä tarkoitusta varten havaitseminen polymeraasiketjureaktiolla (PCR) näyttää olevan sopiva, spesifinen ja herkkä menetelmä. Tällä hetkellä yksittäisille bakteereille on kuitenkin saatavilla vain PCR-menetelmiä. Aiemmissa tutkimuksissa yleinen homologinen DNA-sekvenssi (phoP) kuvattiin Salmonella-, E. coli-, Shigella- ja Citrobacter-lajeissa ja kehitettiin alukkeita, jotka havaitsivat nämä neljä lajia PCR-määrityksessä. Lisätyössä LI ja MUSTAPHA tutkivat näiden phoP-alukkeiden spesifisyyttä neljälle juuri mainitulle lajille (Y. LI, A. MUSTAPHA: Polymeraasiketjureaktiomäärityksen kehittäminen enterobakteerien havaitsemiseksi jauhelihasta. PCR-menetelmän kehittäminen suolistobakteerien havaitsemiseen naudanlihassa).

Die Sensitivität wurde mit den 4 Spezies überprüft: von jeweils einem Stamm E. coli O157:H7, S. Typhimurium, Shigella flexneri und Citrobacter freundii wurden Zellverdünnungen hergestellt. Nach Proteinase K-Verdau, Kochen und Zentrifugation der Bakteriensuspensionen wurde die PCR mit den phoP-Primern durchgeführt. Die Sensitivität wurde für jede dieser 4 Spezies anhand der kürzesten Anreicherungszeit ermittelt, die nötig war, um die niedrigsten Verdünnungstufen zu detektieren.

Weiterhin wurden Rindfleischproben artifiziell mit den vier Pathogenen kontaminiert. Für die Überprüfung der Spezifität wurden 70 verschiedene Stämme eingesetzt. Darunter waren auch 48 andere lebensmittelrelevante Spezies wie beispielsweise Listerien, Yersinien, Bifidobakterien, Enterokokken, Proteus, Mikrokokken u. a. . Das gesuchte PCR-Produkt von 302 Basenpaaren war nur bei den Stämmen der Spezies E. coli, bzw. den Stämmen der Gattung Salmonella, Shigella und Citrobacter nachzuweisen. Bei den anderen untersuchten Stämmen, die nicht diesen Spezies/Genera angehörten, verlief die PCR-Reaktion negativ.

Die Nachweisgrenze in den Bakteriensuspensionen lag bei 900 Zellen für E. coli O157:H7, bei 10 Zellen für S. Typhimurium, bei 950 Zellen für Shigella flexneri und bei 140 Zellen für Citrobacter freundii. Mit diesem PCR-Verfahren konnte in künstlich kontaminiertem Rindfleisch jeweils eine Kolonie bildende Einheit (KbE) dieser 4 Pathogenen nach 10-stündiger Anreicherung wiedergefunden werden. Zusammen mit kulturellen Methoden ist dieses PCR-Verfahren für den Nachweis von E. coli, Citrobacter, Salmonellen und Shigellen in Rindfleisch geeignet. Für die Differenzierung dieser 4 Lebensmittelinfektionserreger sind dann allerdings noch weitere Untersuchungen notwendig.

Lähde: Kulmbach [ PICHNER ]