Nová metóda PCR na detekciu črevných baktérií v hovädzom mäse
Ako vhodná, špecifická a citlivá metóda sa na to javí detekcia pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). V súčasnosti sú však dostupné len metódy PCR pre jednotlivé zárodky. Predchádzajúce štúdie opísali spoločnú homológnu sekvenciu DNA (phoP) u druhov Salmonella, E. coli, Shigella a Citrobacter a vyvinuli priméry, ktoré detegovali tieto štyri druhy v teste PCR. V ďalšej práci LI a MUSTAPHA skúmali špecifickosť týchto phoP primérov pre štyri druhy uvedené vyššie (Y. LI, A. MUSTAPHA: Development of a polymerase chain reaction assay to detectic entericbacterium in mleté hovädzie mäso. Vývoj metódy PCR pre detekcia črevných baktérií v hovädzom mäse).
Die Sensitivität wurde mit den 4 Spezies überprüft: von jeweils einem Stamm E. coli O157:H7, S. Typhimurium, Shigella flexneri und Citrobacter freundii wurden Zellverdünnungen hergestellt. Nach Proteinase K-Verdau, Kochen und Zentrifugation der Bakteriensuspensionen wurde die PCR mit den phoP-Primern durchgeführt. Die Sensitivität wurde für jede dieser 4 Spezies anhand der kürzesten Anreicherungszeit ermittelt, die nötig war, um die niedrigsten Verdünnungstufen zu detektieren.
Weiterhin wurden Rindfleischproben artifiziell mit den vier Pathogenen kontaminiert. Für die Überprüfung der Spezifität wurden 70 verschiedene Stämme eingesetzt. Darunter waren auch 48 andere lebensmittelrelevante Spezies wie beispielsweise Listerien, Yersinien, Bifidobakterien, Enterokokken, Proteus, Mikrokokken u. a. . Das gesuchte PCR-Produkt von 302 Basenpaaren war nur bei den Stämmen der Spezies E. coli, bzw. den Stämmen der Gattung Salmonella, Shigella und Citrobacter nachzuweisen. Bei den anderen untersuchten Stämmen, die nicht diesen Spezies/Genera angehörten, verlief die PCR-Reaktion negativ.
Die Nachweisgrenze in den Bakteriensuspensionen lag bei 900 Zellen für E. coli O157:H7, bei 10 Zellen für S. Typhimurium, bei 950 Zellen für Shigella flexneri und bei 140 Zellen für Citrobacter freundii. Mit diesem PCR-Verfahren konnte in künstlich kontaminiertem Rindfleisch jeweils eine Kolonie bildende Einheit (KbE) dieser 4 Pathogenen nach 10-stündiger Anreicherung wiedergefunden werden. Zusammen mit kulturellen Methoden ist dieses PCR-Verfahren für den Nachweis von E. coli, Citrobacter, Salmonellen und Shigellen in Rindfleisch geeignet. Für die Differenzierung dieser 4 Lebensmittelinfektionserreger sind dann allerdings noch weitere Untersuchungen notwendig.
Zdroj: Kulmbach [ PICHNER ]
